Новый количественный целевой анализ X

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 12856 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Анализ инактивации Х-хромосомы (XCI) часто помогает в диагностике Х-сцепленных признаков, однако точная оценка с использованием современных методов остается сложной задачей. Мы разработали новую стратегию с использованием обогащения Cas9 без амплификации и секвенирования нанопоровых технологий Оксфорда под названием XCI-ONT, чтобы исследовать и точно количественно оценить XCI в гене рецептора андрогенов человека (AR) и гене Х-сцепленного пигментного ретинита 2 человека (RP2). XCI-ONT измеряет метилирование более 116 CpG в AR и 58 CpG в RP2, а также отдельных родительских X-хромосом без систематической ошибки ПЦР. Мы показываем полезность стратегии XCI-ONT по сравнению с методом золотого стандарта XCI на основе ПЦР, который исследует только один или два CpG на ген. Результаты подчеркивают ограничения использования метода золотого стандарта, когда шаблон XCI частично искажен, и преимущества XCI-ONT для строгой количественной оценки XCI. Это исследование представляет собой универсальный XCI-метод исследования ДНК, который очень ценен в клинических и исследовательских рамках Х-сцепленных признаков.

Инактивация Х-хромосомы (XCI) является механизмом компенсации разницы в количестве Х-хромосом между мужчинами (46XY), женщинами (46ХХ) и лицами с Х-анеуплоидиями1. Молекулярный механизм XCI человека не до конца понятен2,3, но исследования показали, что XCI контролируется цис- и транс-действующими факторами в центре X-инактивации (Xic), включая экспрессию гена X-неактивного специфического транскрипта (XIST). и гены X-активного специфического транскрипта (XACT)3. В конечном итоге это приводит к моноаллельной экспрессии, накоплению H3K27me33 и метилированию сайтов CpG вблизи промоторов генов на неактивной Х-хромосоме (Xi) (рис. 1А)4,5,6. Метилирование оказалось важным для поддержания неактивного состояния Си7,8,9,10. XCI у человека инициируется на ранней стадии эмбриональной имплантации3, и выбор того, какую Х-хромосому инактивировать, обычно описывается как случайный процесс, в котором обе Х-хромосомы представлены в равной степени11,12. Однако наблюдалось, что преимущественная инактивация одной Х-хромосомы, так называемая асимметричная XCI, изменяет проявления Х-сцепленного заболевания у женщин-носителей, что указывает на то, что генотип важен при выборе активной Х-хромосомы (Ха), возможно, путем отбор клеток из-за недостатка мутантных клеток13,14,15,16. Во-первых, преимущественное замалчивание патогенного аллеля было связано с селективным выживанием самок или менее тяжелым эффектом Х-сцепленных признаков. Было показано, что сильное отклонение является хорошим индикатором наличия патогенных Х-сцепленных вариантов у женщин-носителей15,17,18, поэтому анализы XCI у родственников часто помогают в интерпретации Х-сцепленных вариантов. Во-вторых, экспрессия патогенного аллеля может приводить к проявлению фенотипов у женщин-носителей Х-сцепленных признаков19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 и может объяснять фенотипические различия, наблюдаемые у больных женщин-носителей и лица с Х-анеуплоидиями21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. Следует отметить, что анализ XCI рекомендуется проводить в соответствующих тканях в разном возрасте и у некурящих37,38,39,40,41,42,43,44. В целом определение асимметрии составляет > 80:20, но из-за ограничений метода золотого стандарта, используемого для анализа XCI, количественная оценка асимметрии не рекомендуется для других случаев, кроме 100:0, что подчеркивает необходимость количественного метода. .

(A) Схема механизма инактивации Х-хромосомы и его эффекта у женщин-носителей Х-сцепленных признаков. Синий: активная Х-хромосома (Ха), красный: неактивная Х-хромосома (Xi), желтая звездочка: патогенный Х-сцепленный вариант. Иллюстрации созданы с помощью Adobe Illustrator 2022 (доступны по адресу https://adobe.com/products/illustrator). (B) В методах золотого стандарта XCI используются чувствительные к метилированию ферменты рестрикции (HpaII), которые разрезают Xa, но оставляют Xi нетронутым. HpaII нацелен на два и один сайт CpG в рецепторе андрогена (AR) и пигментной сетчатке 2 (RP2) соответственно, за чем следует ПЦР и анализ длины фрагмента (FLA), охватывающий полиморфные повторяющиеся области (CAGn или GAAAn), которые разделяют родительские аллели. Иллюстрации созданы с помощью Adobe Illustrator 2022 (доступны по адресу https://adobe.com/products/illustrator). Подход XCI-ONT разрезает ДНК независимо от статуса метилирования, используя обогащение CRISPR-Cas9 тремя гРНК (розовый), фланкирующими интересующую область (ROI) размером ~ 3 т.п.н., охватывающую 116 сайтов CpG в AR и 58 сайтов CpG в RP2. (C) XCI-ONT включает: (1) Дефосфорилирование 5'-концов для уменьшения лигирования адаптеров секвенирования с нецелевыми цепями. (2) Система CRISPR-Cas9 связывается и разрезает ROI, а ДНК имеет хвостик dA для лигирования адаптера со сторонами разреза Cas9, которые фосфорилированы как по 3'-dA-хвосту, так и по 5'-концу. (3) Библиотека секвенирована с использованием Oxford Nanopore Technologies и метода определения оснований Bonito. (4) Вызов повторов путем сопоставления ридов с эталонными геномами, содержащими все возможные повторы в регионах, и риды разделяются на гаплотипы путем построения графика количества ридов с разными повторами. Наконец, вызов и количественная оценка метилирования выполняются с использованием Nanopolish, а данные визуализируются с помощью Integrative Genomics Viewer (IGV). Рассчитывают среднее метилирование ROI и определяют соотношение XCI между двумя Х-хромосомами.

80:20), often used in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be very useful when XCI is modifying disease e.g. in the investigation of carrier females presenting symptoms due to expression of the pathogenic allele (incomplete silencing). Approaches for quantifying the levels of XCI on the maternal and paternal allele have been proposed before but this requires either bisulfite conversion and PCR50 or paired RNA and DNA sequencing data of the XIST gene using informative transcribed heterozygous single nucleotide variants (SNVs) to separate the parental alleles41,51. A SNV is not as informative as repeated elements and can therefore not be used to distinguish between individuals. This highlights the need for a universal quantitative XCI analysis on DNA to be used for research applications and clinical diagnostics related to X-linked traits./p> T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) where carrier females had ~ 100:0 skewed XCI when investigating the AR gene57. The XCI result was confirmed in this study by investigating the RP2 locus of two asymptomatic carrier females (IV:8, III:10) and one asymptomatic non-carrier female (III:7) (Supplementary Fig. 1). The two asymptomatic carrier females presented a ~ 100:0 skewed XCI status consistent with the maternal X-chromosome being silent (carrying the pathogenic variant). The asymptomatic non-carrier female had expression of both alleles i.e. a random XCI status, however the method presents variable result between experiments and contrasting results in the different genes (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). In addition, three females (female I, II and III) were investigated using the golden standard method. All individuals showed different ratios of XCI for both AR (female I 62:38, female II 47:53 and female III 81:19) and RP2 (female I 81:19, female II 60:40 and female III 87:13) (Table 1, Supplementary Fig. 2)./p> 80:20), often assisting in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be highly useful in the investigation of carrier females manifesting symptoms due to expression of the pathogenic allele. Quantification of XCI can illuminate the mechanism of disease, and provide useful information for improving prenatal risk assessment36, diagnostics and treatment development of X-linked traits. Lastly, we would like to illuminate the possibility that different disorders and pathogenic variants requires different levels of expression to develop symptoms and stress the use of a quantitative XCI investigation to answer these questions. A related application for XCI-ONT is monitoring pharmacological Xi reactivation, which has been suggested as treatment for X-linked disorders due to skewed XCI59,60,61,62./p> T;p.(Arg1190Cys) variant in the TAF1 gene (NM_004606.4)57. DNA from two carrier females (III:10, IV:8) and one non-carrier female (III:7) as well as three unrelated females (female I-III) was included in the current analysis./p> 20). The data were visualized by plotting the number of reads (y-axis) containing any repeat in the range of 5–40 repeats in AR or 5–30 repeats in RP2 (x-axis) (Supplementary Fig. 3). The reads were divided into haplotypes based on the repeat count and comparison with the golden standard results. Methylation calling and calculation of the methylation frequency was performed using Nanopolish software package (version 0.12.0). Only sites with a log-likelihood ratio > 2.5 (methylated) or < − 2.5 (unmethylated) were included in the methylation analysis (Supplementary Fig. 5). Bam-files were converted using the “converting bam for igv” package66 and the methylation status was visualized using Integrative Genomics Viewer bisulfite mode CG (version 2.10.0). The XCI status was established by using the average methylation frequency in the chrX:67543761–67546170 region (AR gene, 116 CpG sites, hg38) and chrX:46836539–46837273 region (RP2 gene, 58 CpG sites, hg38) followed by calculating the ratio of the average methylation between the alleles in each gene./p>

Новости

Новый количественный целевой анализ X